REPLICACION DE ADN

Es un proceso que se da constantemente en diferentes organismos, pertenece a celulas de carácter asexual. Esta replicación se da durante el ciclo celular, el cual viven todas las células.

CICLO CELULAR

El ciclo celular es una sucesion controlada de eventos en los cuales una celula pequeña crece y se convierte en una celula mas grande, dividiendose luego para formar dos celulas mas pequeñas. la celula que se divide se llama la celula madre y, las celulas recien formadas, las celulas hijas:

durante el ciclo una celula crece a si tramaño maximo y duplica cada cromosoma . entonces se divide en dos, con cada celula hija se recibe una copia de cada cromosoma junto con la mitad del citoplasma. en una celula humana de divicion rapida, el ciclo entero dura cerca de 24 horas.

el ciclo celular tiene tres etapas principales: la interfase, la mitosis y la citogenecis.

	ETAPAS DEL CICLO CELULAR
ETAPA	SUCESOS PRINCIPALES
INTERFASE          ·         Periodo G1          ·         Periodo S          ·         Periodo G2 MITOSIS          ·         Profase          ·         Metafase          ·         Anafase          ·         Telofase CITOGENESIS	Síntesis y reparación Síntesis de materiales; crecimiento celular Replicación de las moléculas de ADN Reparación de los errores del nuevo ADN sintetizado Formacion de dos nucleos a partir de uno Acortamiento de los cromosomas; desaparición de la envoltura nuclear; formación de las fibras de huso Los cromosomas se alinean entre los dos polos; las fibras de huso se unen a los centrómeros Los centrómeros se dividen; las cromatidas hermanas se vuelven cromosomas y son haladas por las fibras del huso opuestos Las fibras del huso desaparecen, la envoltura nuclear se forma al redeor de cada juego de cromosomas El citoplasma se parte para formar dos células, cada una con un nucleo y la mitad del material celular

Las células asexuales van a desarrollar el proceso de mitosis, mientras las células sexuales van a desarrollar la meiosis.

Una celula asexual es una celula somatica, todas las células de nuestro cuerpo son somaticas a excepción de las células germinales, de los cuales se forman los gametos (ovulos y espermatizoides).

 La replicación de ADN se da en la interfase, es importante que al momento de la replicación el ADN se encuentre ordenado en el nucleo.

El primer paso es organizar el ADN para la replicación ya que se encuentra disperso en el nucleo, se organiza formando cromosomas. Para que se formen los cromosomas necesitamos unas proteínas llamadas histonas. Hay unas histonas que son ricas en licina y actinina las cuales enrrollan el ADN cada cierto numero de nucleótidos, hasta obtener un cromosoma.

Ese ADN enrrollado cuando se ha duplicado aparecen cromatidas hermanas, unidos por un punto llamado centrómero. Los extremos reciben el nombre de telometro. Generalmente se encuentra un brazo mas corto que otro los cuales  reciben el nombre de P y Q respectivamente.

Ese ADN va a tener algunas regiones que se van a poder expresar y otras que no. El ADN se va a dividir el axones, exones y en intrones.

Un exón es la parte del ADN que se expresa y se codifica para una proteína, mientras que los intones se cree que no hacen nada. Se ha encontrado que intrones es lo que mas prevalece.

El ADN esta compuesto por nucleótidos las cuales hay 4 tipos : adenina, timina, citosina, guanina (purinas y pirimidinas). Las cuales permiten que las dos hebras que forman el ADN  se unan por medio de puentes de hidrogeno.

Watson y Crick , postularon que el ADN estaba formado por dos hélices.

Que necesita la celula para replicar ADN?

·       -->  nucleotidos libres que estén hay, para que halla material de donde sacar y hacer una cadena.

Un nuleotido esta formado por: desoxirribosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El grupo fosfato va a estar hacia el exterior de hebra de ADN y las bases nitrogenadas hacia el interior, las cuales van a estar unidad por puentes de hidrogeno.

Siempre a adenina se une a la guanina por dos puentes de hidrogeno y la timina se une con la citosina por tres puentes de hidrogeno.

Los nucleótidos se encuentran unidos en secuencia 3’-5’

·        --> Proteínas como: helicasa, topoisomerasa, ligasa, ssbp, polomerasas, que son las que nos van a permitir que se de todo el proceso.

Una vez que se comprobó que el ADN era el material hereditario y se descifró su estructura, lo que quedaba era determinar como el ADN copiaba su información y como la misma se expresaba en el fenotipo. Matthew Meselson y Franklin W. Stahl diseñaron el experimento para determinar el método de la replicación del ADN. Tres modelos de replicación era plausibles.

1. Replicación conservativa durante la cual se produciría un ADN completamente nuevo durante la replicación.

2. En la replicación semiconservativa se originan dos moléculas de ADN, cada una de ellas compuesta de una hebra de el ADN original y de una hebra complementaria nueva. En otras palabras el ADN se forma de una hebra vieja y otra nueva. Es decir que las hebras existentes sirven de molde complementario a las nuevas.

 3. La replicación dispersiva implicaría la ruptura de las hebras de origen durante la replicación que, de alguna manera se reordenarían en una molécula con una mezcla de fragmentos nuevos y viejos en cada hebra de ADN.

 El experimento de Meselson-Stahl consiste en cultivar la bacteria Escherichia coli en un medio que contenga nitrógeno pesado (¹⁵Nitrógeno que es mas pesado que el isótopo mas común: el ¹⁴Nitrógeno ). La primera generación de bacterias se hizo crecer en un medio que únicamente contenía ¹⁵Nitrógeno como fuente de N. La bacteria se transfirió luego a un medio con ¹⁴N. Watson y Crick habían pronosticado que la replicación del ADN era semiconservativa, de ser así el ADN extraído de las bacterias luego de cultivarlas por una generación en ¹⁴N tendría un peso intermedio entre el ADN extraído del medio con ¹⁵N y el del extraído de medio con ¹⁴N y así fue.

Los detalles del experimento que incluye un proceso de ultracentrifugación en cloruro de Cesio (CeCl₂) puede encontrarse en el Curtis.

La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada generación celular, necesita de muchos "ladrillos", enzimas, y una gran cantidad de energía en forma de ATP (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular las células pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energía para la siguiente fase de la división celular). La replicación del ADN en el ser humano a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo, en procariotas a 500/segundo. Los nucleótidos tienen que se armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

La iniciación de la replicación siempre acontece en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la replicación, requiere entre otras de las enzimas helicasas para romper los puentes hidrógeno y las topoisomerasas para aliviar la tensión y de las proteínas de unión a cadena simple para mantener separadas las cadenas abiertas.

Una vez que se abre la molécula, se forma una área conocida como "burbuja de replicación" en ella se encuentran las "horquillas de replicación" . Por acción de la la ADN polimerasa los nuevos nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas".

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo  en la dirección 5' to 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos mostraron que, una cadena formará una copia continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki . La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada.

Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la cadena en crecimiento.

ARTICULO

Marcaje no Enzimático y Detección no Radioactiva

de ADN.

Dannelys Pérez-Bello1, Liliam López-Dobarganes2, Ana Maria Riveron-Rojas1, David

Higginson-Clarke1, Mirta Zayas1, Nelson Diaz1, Ramón Gonzalez3, Marquiza Sablón

Carrazana1, Rafaela Perez1, Chryslaine Rodriguez-Tanty1*.

1 Centro de Neurociencias de Cuba. Ave 25 y 128, CP: 11600, C. Habana, Cuba; e-mail: chris@cneuro.edu.cu. 2

Facultad de Biología, Universidad de La Habana. 3 Centro Nacional de Investigaciones Científicas.

RESUMEN: Varios métodos enzimáticos y químicos se han desarrollado para el marcaje no-radiactivo de

sondas de ADN. Las reacciones de transaminación catalizada por bisulfito y la acilación del ADN son métodos químicos que se emplean para obtener sondas de ADN marcados. Si estas reacciones se llevan a cabo bajo condiciones de desnaturalización del ADN, el marcaje se incrementa. Asimismo, la detección de la marca se puede incrementar con el uso de un brazo espaciador apropiado y también cuando la detección de la misma se realiza en ADN de simple cadena. En este trabajo, se optimizó un procedimiento para obtener sondas de ADN marcado mediante síntesis química, usando el radical p-bromobenzoilo como marca. Nosotros desarrollamos un método para separar ADN de simple cadena de ADN de doble cadena a través de cromatografía de hidroxilapatita. La sensibilidad de la detección fue evaluada mediante ensayos inmunoenzimáticos colorimétricos con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-BLC (5H11E5), anteriormente obtenido.

ABSTRACT:  Various enzymatic and chemical methods for the preparation of non-radioactive nucleic acid

probes have been developed. Bisulfite-catalyzed transamination and acylation reactions into DNA are employed, as a chemical method, to obtain labeled DNA probes. If the reactions are carried out under DNA denaturalization condition, the labelling could be increased. Likewise, the label detection could be increased by means of the use of an appropriated spacer arm and also, by performing the label detection in single-stranded DNA. In this work, the procedure for obtainment labelled DNA probes, by chemical synthesis, using the p-bromobenzoyl radical as label was carried out. We developed a method for separating single-stranded DNA (s.s.DNA) from double stranded DNA, through Hydroxylapatite (HA3) chromatography. The sensitivity in the label detection was evaluated by chromogenic dot immunobinding assays using an anti-BLC monoclonal antibody (5H11E5), previously obtained.

Palabras claves: sondas de AND no radiactivas, reacción de transaminación catalizada por bisulfito,

desnaturalización de ADN y separación de ADN de simple cadena.

Key words: Non-radioactive nucleic acid probes, bisulfite-catalyzed transamination reaction, denaturalized DNA and single-stranded DNA separation.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el marcaje in vitro no radioactivo de los ácidos nucleicos ha constituido una importante

herramienta para el análisis de genes en el diagnóstico médico. De este modo, estos métodos han sustituido a los métodos radioactivos, debido a la inestabilidad de la sonda, el alto costo y los requerimientos especiales que conlleva trabajar con materiales radioactivos.1-4 La introducción de marcas inmunoquímicas en la molécula de citidina puede llevarse a cabo a través de una reacción de transaminación del grupo amino en posición 4 de la base pirimidínica de la molécula de citidina, con el empleo de bisulfito de sodio y diferentes aminas, y posteriormente la acilación del grupo amino.5-7 Shulman71 y Draper73 estudiaron la cinética de esta reacción en el ARN. Este procedimiento también fue empleado para introducir en el ADN la molécula de biotina, con el objetivo de obtener sondas biotiniladas. Más recientemente, Avignolo y col. 8, 9 realizaron estudios para optimizar las condiciones experimentales de este método.

En el presente trabajo introducimos el radical p-bromobenzoilo, como una marca inmunoquímica, en la molécula de 5-metil citidina en el ADN, según los procedimientos desarrollados por Avignolo y col.8

PARTE EXPERIMENTAL

Obtención de ADN simple cadena (sc).

El ADN de timo de ternera (Koch-Light Laboratory) se disuelve (1mg/mL) en una disolución tampón de NaH2PO4 (0.05 M, pH=6.8) y a continuación se desnaturaliza térmicamente ( 5 min a 100 ºC) e inmediatamente, después, se enfría a 0 ºC.

A grosso modo la columna de hidroxiapatita se prepara de la siguiente forma. 5 g de hidroxiapatita (Laboratorio de BioMateriales, CNIC) se resuspenden en 10 mL de un tampón de NaH2PO4 (0.05 M, pH=6.8). La matriz se adiciona a una columna (de 5x1 cm), la cual se enfría a 0 ºC.

La muestra de ADN desnaturalizado (1mg/mL, 5 mL) se adiciona a la columna y a continuación, la misma se

eluye con un gradiente del tampón de NaH2PO4 (0.05 M-0.2 M) en frascos plásticos de 2 mL. La velocidad de elución fue de 30 mL/h. Una vez eluido todo el ADN la columna se regenera con un tampón de NaH2PO4 (0.5 M, pH=6.8) a un flujo de regeneración de 50 mL/h.

Detección de ADN doble cadena (dc) y simple cadena (sc) en geles de agarosa con anaranjado de

acrilina.

La tinción del ADN sc y dc se lleva a cabo in situ en el gel de agarosa de corrida de electroforesis. La

preparación del gel se llevó a cabo utilizando agarosa (Promega) al 1% en el tampón de NaH2PO4 (0.01 M) y adicionando anaranjado de acridina. La concentración final de anaranjado de acridina es de 3 mg/mL en el gel.

Marcas Inmunoquímicas.

La síntesis de agentes acilantes, empleando el radical p-bromobenzoilo como marca, fue llevada a cabo en el

Laboratorio de Síntesis del centro de Neurociencias. Los agentes acilantes utilizados fueron: éster de N-hidroxisuccinimida del ácido p-bromobenzoico (B-NHS, 1´), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-p-(bromobenzoilamido)propionico (BLC2-NHS, 2´) y éster de Nhidroxisuccinimida del ácido 6-p-(bromobenzoilamido)caproico (BLC5-NHS, 3´).

Conjugación de proteína-BCL5:

El radical p-bromobenzoilo fue unido a diferentes proteínas, como: IgG ratón (antiratón-carnero) y gelatina

mediante la acilación de las proteínas con BLC5-NHS.

Marcaje de ADN en fase líquida.

La reacción de transaminación tuvo lugar con ADN de timo de ternera (0.2376 mg/mL ó 1.7 mg/mL, Koch-Light Laboratory) en presencia de bisulfito de sodio (2 M) y etilendiamina (1 M), pH 7, durante 1 hora a 100 ºC. El ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto y NaCl (0.2 M). La fracción de ADN transaminada fue resuspendida en un mínimo volumen de una disolución de NaHCO3 (0.1 M, pH= 8.5). A continuación, se realizó la acilación del ADN transaminado con el empleo de los agentes acilantes: B-NHS, BLC2-NHS, y BLC5-NHS, en presencia de trietilamina a pH 8,5. La mezcla de reacción fue calentada a 100 ºC durante 1hora. El ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto y una disolución de NaCl (0.2 M) y luego, se purificó en una columna de Sephadex G-25. Finalmente, el ADN marcado (BLC5-DNA, BLC2-DNA y B-DNA) fue resuspendido en H2O destilada estéril y guardado a 4 ºC.

Fijación del ADN de timo a membranas.

Las disoluciones de ADN fueron calentadas a 100 ºC durante 10 min., e inmediatamente enfriadas en hielo. A continuación, se aplicaron 10 μL de ADN sobre el soporte sólido. La membrana se secó a temperatura

ambiente. Las membranas de nitrocelulosa se lavaron dos veces con 50 mL de una disolución 6 x SSC y se

secaron a temperatura ambiente, y posteriormente a 80 ºC a presión reducida, durante 2 horas.

En el caso de las membranas de nylon, una vez aplicada la muestra, se secaron a 80 ºC durante 2 horas.

Detección calorimétrico inmunoenzimático de la marca (Dot Blot)

Las membranas se sumergen en una disolución de leche descremada al 5% en tampón de PBS (pH 7,2)

durante 90 min. a 37 ºC. A continuación se lavó con PBS y seguidamente, se incubó en una disolución del AcM 5H11E5 1 (10μg/mL) en PBS durante 90 min a 37 ºC. Las membranas se lavaron dos veces con disolución de Tween 80 (0,5% en PBS). Posteriormente se sumergió en una disolución de conjugado anti-IgG de ratón (peroxidasa o fosfatasa alcalina) (1: 1 000 y 1:5 000 a partir de 1 mg/mL, respectivamente) en Tween 80 ( 0,005%) y leche descremada (1%) en PBS, durante 90 min. a 37 ºC. Seguidamente, las membranas se lavaron dos veces con disolución de Tween 80 (0,5%) en PBS.

Finalmente, se le adicionaron a las membranas una disolución de aminoetilcarbamida (0,2 mg/mL) en acetato

de amonio (5 mM) y H2O2 (8.8 mM) para el conjugado de PO.

Cuando se empleó FO las membranas se sumergieron en una disolución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/ azul de nitrotetrazolium en agua (tabletas, 10 ml).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La introducción del radical p-bromobenzoilo en el ADN desnaturalizado se realizó a través de las reacciones de

transaminación y acilación del grupo amino de la molécula de citidina (Fig. 1).

Como se observa en la Fig. 1, se emplearon como agentes acilantes tres derivados de tipo ésteres succinimido: B-NHS, BLC2-NHS y BLC5-NHS. Las reacciones se llevaron a cabo a la temperatura de desnaturalización del ADN durante 1 hora. Así, se obtuvieron los análogos de nucleótidos: 4-N-(p-bromobenzoilaminoetil) 2´-Odeoxicitidina (1´), 4-N- { 2-[ 3-(p-bromobenzoilamino)propilamino] etil } 2´-O-deoxicitidina (2´) y 4-N- { 2-[ 6-(pbromobenzoilamino) caproilamino] etil }-2´-O-deoxicitidina (3´).

Los tres tipos de ADN marcado se denominaron: BLC5-ADN, BLC2-ADN y B-ADN. En todos los casos la marca fue separada de la base pirimidínica de la citidina, con el empleo de brazos espaciadores de diferente longitud de la cadena (10, 7 y 3 átomos, respectivamente).

Este método resultó ser un método sencillo y de bajo costo en comparación con los métodos tradicionales de introducción in vitro en los que se emplean enzimas y derivados trifosfatados de los nucleósidos modificados. Los resultados de la detección de la marca (Dot-Blot) incorporada al ADN doble cadena (dc) se muestran en la Fig. 2. 

Como se observa de la Fig. 2, en el filtro A, el reconocimiento de la marca se llevó a cabo con 26 μg de ADN marcado desnaturalizado, en cada caso. La línea control (arriba, filtro A) no muestra señal detectable en el caso de ADN no marcado (control negativo) y una señal detectable es obtenida para BLC5 conjugado a gelatina (control positivo). Si comparamos las intensidades de color del reconocimiento del ADN marcado con los tres brazos espaciadores de diferente longitud de la cadena (3, 7 a 10 átomos), apreciamos que cuando el brazo espaciador fue de 10 átomos (BLC5-ADN) el reconocimiento fue mejor que con 3 ó 7 átomos (BLC2-ADN y BADN), respectivamente. Como se observa, el nivel de sensibilidad aumenta en la medida que el largo del brazo espaciador se hace mayor. Esto se debe, posiblemente, a que aumenta la accesibilidad del AcM sobre el radical p-bromobenzoilo, en la medida que el brazo espaciador se hace mayor. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Avignolo y col.8 cuando emplean brazos espaciadores de 6 y 13 átomos de longitud para la introducción de la biotina (5 veces superior con 13 átomos). En los filtros B, C y D (Fig. 2) se observan los límites de detección obtenidos para cada ADN marcado: BLC5- ADN, BLC2-ADN y B-ADN, respectivamente. De esta manera encontramos que el reconocimiento de la marca por el AcM en el BLC5-ADN (filtro B) es dos veces más sensible que en los BLC2-ADN y B-ADN (filtros C y D).

Estos resultados concuerdan con la escala, establecida anteriormente, de afinidad del AcM por la marca en los diferentes brazos espaciadores diseñados. Por ello, se seleccionó como agente acilante el BLC5-NHS.

Se realizó un ensayo inmunoenzimático colorimétrico con ADN dc desnaturalizado (BLC5-ADN) sobre

membrana de nylon para determinar el límite de detección del AcM (5H11E5) contra la marca, empleando un conjugado de carnero anti-ratón-fosfatasa alcalina (FA) (Fig. 3).

De acuerdo a la Fig. 3, el límite de detección para el BLC5-ADN fue de 19,5 pg, el cual resultó 70 veces más sensible que cuando se utilizó PO y membrana de nitrocelulosa (Fig. 2).

En la reacción de acilación uno de los factores que determina la incorporación de la marca en el ADN es el

impedimento estérico que puede encontrar el agente acilante en la estructura de doble hélice. Por esta razón,

para incrementar la eficiencia del marcaje del ADN se realizaron ensayos empleando ADN de simple cadena (sc), obtenidos por cromatografía de adsorción con hidroxilapatita (HA).

Así, ADN dc desnaturalizado se introdujo en una columna de HA y se eluyó con una disolución de NaH2PO4 (0.5M, pH 6.8). De acuerdo con la electroforesis del ADN, en agarosa con anaranjado de acridina, se obtuvo una fracción de ADN enriquecida en sc (Fig. 4).

A continuación, se llevó a cabo el marcaje del ADN sc con BLC5-NHS, como agente acilante.
La detección de la marca en el BLC5-ADN sc, sobre una membrana de nylon, se llevó a cabo con el empleo del AcM 5H11E5 y con el conjugado de carnero anti-ratón-PO. La sensibilidad de la detección de la marca fue de 313 pg, lo que representa 4,5 veces más sensible que cuando se emplea ADN dc desnaturalizado marcado y nitrocelulosa como soporte sólido (Fig. 5).

REFERENCIAS

1. Rodríguez-Tanty, Ch., López-Canovas, L., López-Braut, A., Rivero-Paredes, M., Higginson-Clarke, D.,

Vélez-Castro, H., Riveron, A-M., Macías, A. Nucleosides and Nucleotides, 14, 219. 1995.

2. Rodríguez-Tanty, Ch., Higginson-Clarke, D., Hernández, M., Pérez, R., Riveron, A-M., Macías, A.

Nucleosides and Nucleotides, 16, 455,1997.

3. Rodríguez-Tanty, Ch., Pérez, R., Miranda, J., Vélez- Castro, H., Rosado, A., Macías, A., Galán, L.,

Higginson-Clarke, D., Riveron, A-M. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20, 1449-14461,2001.

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

4. Rodríguez-Tanty, Ch., Pérez, R., Miranda, J., Vélez-Castro, H., Rosado, A., Macías, A., Galán, L.,

Higginson-Clarke, D., Riveron, A-M. Nucleosides and Nucleotides, 18, 1113,1999.

5. Schulman, L. D.; Pelka, H.; Reines, S. A., Nucleic Acids Research, 9, 1203.,1981

6. Draper, D., Nucleic Acids Research, 12, 989,1984.

7. Safarti, S.R.; Pochet, S.; Guerreiro, C.; Namame, A.; Huynh-Dinh, T.; Igolen, J., Tetrahedron, 43,

3491,1987.

8. Avignolo, A.;Hull, R.; Nucleic Acids Research, 14, 9965,1986.

9. Avignolo, C., Roner, R., Cai, S. y Bignone, F.A., J. Biochem. Biophys. Meth., 23, 193-